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宜城教育资源网www.ychedu.com免费5.3《血红蛋白的提取和分离》教案设计含教学反思【人教版】生物选修一专题5DNA与蛋白质技术课题5.3血红蛋白的提取和分离一、【课题目标】(一)知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理(二)过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求,注意按照操作提示进行相关步骤(三)情感、态度与价值观初步形成科学的思维方式,发展科学素养和人文精神二、【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法三、【课题难点】样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填四、【教学方法】启发式教学五、【教学工具】多媒体课件六、【教学过程】(一)引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者,是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢?(二)进行新课1.基础知识蛋白质的物化理性质:形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别,由此提取和分离各种蛋白质。1.1凝胶色谱法(分配色谱法):(1)原理:(图5-13a)分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。(2)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。(3)分离过程:(图5-13b)混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子*洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。1.2缓冲溶液(1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4等),调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。(2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。1.3凝胶电泳法:(1)原理:不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。[思考]阅读教材后,填写下表: 决定运动方向 形成库仑力 形成阻力 决定运动速率电荷性质 √   电荷量  √  √分子形状   √ √分子大小   √ √(2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。(3)分离过程:在一定pH下,使蛋白质基团带上正电或负电;加入带负电荷多的SDS,形成"蛋白质-SDS复合物",使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。2.实验设计2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤?样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。思考:是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的?为什么?不是。因为蛋白质的来源和性质不同,分离方法差别很大。2.2选择实验材料(1)你认为鸟类血液和哺乳动物血液中,最好哪种血液来提取血红蛋白?为什么?哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核,血红蛋白含量高。(2)请阅读教材,认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题:血液由和两部分组成。血细胞中细胞数量最多,细胞的含量最高的化合物是。该化合物是由和构成的,其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的基团。2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为:洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么?除去血浆蛋白的杂蛋白,有利于后续步骤的分离纯化。红细胞的洗涤过程为血液+柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞+5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色思考:加入柠檬酸钠有何目的?为什么要低速、短时离心?为什么要缓慢搅拌?防止血液凝固;防止白细胞沉淀;防止红细胞破裂释放出血红蛋白。思考:你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来?加入蒸馏水,用玻璃棒快速搅拌一段时间。补充:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放和分离。此时,红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢?由于它们的密度不同,科学家采取了离心分离的方法:红细胞破碎混合液→中速长时离心(2000c/min×10min)→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢?。透析。半透膜的选择透过性,大分子物质不能通过半透膜,离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中,血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH=7的磷酸缓冲液中。思考:为何使用pH=7的磷酸缓冲液?为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量?维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。总结:通过以上四个基本过程,红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢?我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离(凝胶色谱操作)。2.5凝胶色谱分离蛋白质包括:制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。根据教材图5-19,说出制作色谱柱需要的材料。橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱柱的制作过程:准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材:色谱柱的装填过程。步骤 操作要求① 操作要求 色谱柱垂直固定在支架上② 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量③ 配制悬浮液 凝胶颗粒+蒸馏水→充分溶胀  凝胶颗粒+洗脱液→沸水浴④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入;轻轻敲打⑤ 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h样品加入和洗脱。其基本过程是:调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质至此,血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中,应当注意以下事项:(1)红细胞的洗涤:洗涤次数不能过少;低速、短时离心。(2)凝胶的预处理:沸水浴法时间短,还能除去微生物和气泡(3)色谱柱的装填:装填尽量紧密,降低颗粒间隙;无气泡;洗脱液不能断流。(4)色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。(三)课堂总结、点评(四)实例探究例1利用凝胶色谱法,什么样的蛋白质先洗脱出来()A. 相对分子质量大的B. 溶解度高的C. 相对分子量小的D. 所代电荷多的解析:凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道,路程较长,移动速度较慢;相对分子质量大的蛋白质,路程较短,移动速度较快,首先洗脱出来。答案:A例2蛋白质提取和分离分为哪几步()A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析:蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术答案:C☆综合应用例3用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质()A路程较长,移动速度较慢B路程较长,移动速度较快C路程较短,移动速度较慢D路程较短,移动速度较快解析:在小球体内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。答案:D(五)巩固练习1.凝胶色谱法分离蛋白质的依据是()A.对其他分子的亲和力B.溶解度C.所带电荷多少D.相对分子质量的大小2.凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是()A.糖类化合物B.脂质C.蛋白质D.核酸3.选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料,有何好处()A.血红蛋白是有色蛋白B.红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高D.红细胞DNA含量高4.将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时,第二层是()A.甲苯B.血红蛋白水溶液C.脂溶性物质的沉淀层D.其他杂质的沉淀5.血红蛋白因含有()而呈红色A.O2B.COC.CO2D.血红素6.下列操作正确的是()A.分离红细胞时采用低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液,透析12h7.样品的加入和洗脱的叙述正确的是()A.先加入1ml透析后的样品B.加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C.如果红色带均匀一致的移动,说明色谱柱制作成功D.洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是()A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化D.可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度9.凝胶色谱法操作正确的是()A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴B.将橡皮塞下部切出凹穴C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10.样品的加入和洗脱的操作不正确的是()A.加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后,打开下端出口,使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端,不要破坏凝胶面答案:1.D2.A3.A4.D5.D6.D7.C8.B9.A10.D七、【课余作业】1、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?2、与其他真核细胞相比较,红细胞有什么特点?这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意义?八、【教学体会】本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展,说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性,并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性,让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展,激发学生的学习兴趣,然后指出本课题的学习意义,让薛生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法九、【资料袋】凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法也称为分配色谱法,它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体,这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩散运动,相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢。因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,这种现象又叫分子筛现象。此外,凝胶本身具有三维网状结构,相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大,而相对分子质量小的分子通过时阻力小,因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。 宜城教育资源网www.ychedu.com
免费5.3《血红蛋白的提取和分离》教案设计含教学反思【人教版】生物选修一
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